多发性骨髓瘤硼替佐米耐药机制研究

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编者按

多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞肿瘤,以高钙血症、肾功能损害、贫血及骨病为显著临床特征。染色体高度不稳定性和克隆进化是MM复发难治的根源。近日,中国医学科学院血液病医院邱录贵教授团队与美国爱荷华大学湛凤凰教授团队的关于染色体不稳定基因NEK2调控NF-κB信号通路参与MM骨病及硼替佐米耐药的作用机制这一研究成果连续在《白血病》(Leukemia)及《临床研究杂志(J Cli Inves)杂志发表,揭示MM骨病及获得性耐药的发生机制,从而为治疗复发难治MM患者提供新的治疗靶点。

邱录贵教授团队:多发性骨髓瘤骨病发病机制研究取得重要进展

▲《临床研究杂志》(J Cli Inves)6月4日在线发表本项研究。

前期结果

课题组前期合作研究证实了染色体不稳定基因NEK2在MM细胞尤其是治疗后耐药的MM克隆中表达显著增加,NEK2的表达水平与患者MM相关骨病严重程度呈正相关,NEK2通过激活NF-κB信号途径,上调MM细胞中细胞因子heparanase(HPSE)的表达并分泌到周围骨髓微环境中,促进微环境中破骨细胞的分化成熟,增加破骨细胞活性,抑制成骨细胞活化,参与骨髓瘤相关骨病的发生发展。研究首次提出治疗后残留的耐药MM克隆高水平表达NEK2蛋白是导致MM患者骨髓瘤骨病持续存在甚至加重的重要调控因子。相关研究成果已在2017年7月的《白血病》(Leukemia)杂志上发表。

进一步探索

为了进一步明确NEK2介导MM骨病及耐药的分子机制,体内外研究揭示如下现象:(1)NEK2表达与骨髓瘤原代细胞中NF-κB活化程度正相关;(2)NEK2激活或抑制的基因中超过40%是p65的直接靶标;(3)双荧光素酶报告基因检测显示p65在NEK2-OE细胞中转录活性上调;(4)ChIP-qPCR证实p65直接结合于HPSE的基因组DNA序列并上调NEK2-OE细胞中HPSE的表达;(5)应用蛋白质印迹及免疫荧光技术发现NEK2阳性的骨髓瘤原代细胞中磷酸化p65增加和(6)IκBα蛋白(经典NF-κB途径的抑制剂)的下降,从而上调核内活性p65的水平。IKKα抑制剂BAY11-7082和IKKβ抑制剂BMS-345541可以阻断NEK2对HPSE表达的促进作用,进一步证明NEK2通过激活IKK复合物(IKKα/β/γ)调节HPSE表达。NEK2和NF-κB通路之间存在直接联系。IKK复合物可以被TAK1,TBK1和AKT激酶或K63、M1连接的多聚泛素链直接激活,并导致癌细胞中IκBα的泛素化和蛋白酶体降解。通过连续亲和纯化/质谱法及免疫共沉淀,研究证实NEK2直接结合PP1α,后者是AKT通路的抑制因子。NEK2可通过磷酸化PP1α抑制其活性,导致AKTS473残基的磷酸化活化,继而激活IKK级联进入经典的NF-κB途径:IKK降解IκBα并释放p65,导致p65转入核内,通过激活其靶基因来驱动硼替佐米耐药性。

目前已知5种主要转录因子(NF-κB1/p105,NF-κB2/p100,RelA/p65,RelB和RelC)是NF-κB家族的主要成员,经典和非经典性NF-κB通路在骨髓瘤发生和发展中起着关键作用,下一步研究的重点是确定NEK2是否仅激活经典的NF-κB,还是同时也激活骨髓瘤中的非经典NF-κB途径。

MM新的耐药机制

蛋白酶体抑制剂的出现彻底改变了多发性骨髓瘤的治疗格局。硼替佐米广泛应用于多发性骨髓瘤的诱导和维持治疗。但是,硼替佐米具有剂量限制性毒性,并且随着病程延长,骨髓瘤细胞对硼替佐米治疗的敏感性逐渐下降,需要更有针对性的治疗来克服耐药。

研究发现USP7可结合于NEK2,USP7-NEK2的相互作用存在于多种骨髓瘤及实体肿瘤细胞系,可以导致NEK2的去泛素化并稳定其结构。由于基因组检测未发现NEK2位点的扩增或突变,USP7的稳定作用为NEK2表达水平升高提供了合理解释。USP7是去泛素化酶USP家族的成员,在骨髓瘤中普遍过表达,USP家族可稳定癌基因、失活抑癌基因,因而受到关注。研究表明,USP7-shRNA可以逆转NEK2的促肿瘤效应。USP7抑制剂P5091亦可杀伤骨髓瘤细胞,并且能够在体内外模型中克服NEK2诱导的硼替佐米耐药,这表明翻译后修饰在NEK2相关细胞凋亡、存活和耐药中起十分重要的作用。

正常情况下,NEK2在除有丝分裂期外细胞周期的大多数阶段都存在,在有丝分裂前,靠近C末端的KEN盒会被泛素化并被蛋白酶体降解。小分子药物INH1可以通过抑制NEK2与HEC1的结合促进NEK2经蛋白酶体降解。与P5091的情况一样,体内外实验证实INH1对NEK2-OE骨髓瘤细胞具有更显著的细胞毒性。基于这些结果,我们认为NEK2通过增加去泛素化逃避蛋白酶体的降解。

总之,本研究揭示了一种NEK2与USP7相互作用驱动多发性骨髓瘤耐药的新机制,而二者的抑制剂INH1和P5091可以克服硼替佐米耐药。完全缓解的患者微小残留病中也可检测到NEK2水平升高,此时使用NEK2或USP7抑制剂靶向NEK2可能更有助于清除MM残留耐药克隆。

邱录贵教授团队:多发性骨髓瘤骨病发病机制研究取得重要进展

▲ 图1 USP7通过去泛素化结合和稳定NEK2,导致骨髓瘤细胞中NEK2蛋白水平升高。NEK2结合和磷酸化失活PP1α,干扰其对AKT的抑制作用。活性AKT激活经典NF-κB途径,通过IKK、IκBα、p65的级联磷酸化,释放p65入核发挥转录因子活性,促进耐药基因的转录。

结论

肿瘤细胞耐药是困扰临床治疗的关键问题,完全缓解后残留耐药MM细胞是疾病复发的根源。本研究系统阐明了MM细胞中高表达NEK2并参与MM细胞耐药及骨髓瘤骨病发病的分子机制。为靶向NEK2抑制其活性、促进其降解,从而逆转骨髓瘤骨病以及MM复发耐药提供重要的理论依据。

专家简介

邱录贵教授团队:多发性骨髓瘤骨病发病机制研究取得重要进展

邱录贵 教授

主任医师 博士生导师

中国医学科学院血液学研究所血液病医院教授

造血干细胞移植中心副主任、血液肿瘤科主任

兼天津脐带血干细胞细胞库主任

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参考文献

Destabilizing NEK2 overcomes resistance to proteasome inhibition in multiple myeloma

NEK2 induces osteoclast differentiation and bone destruction via heparanase in multiple myeloma

 

始发于微信公众号: 中国医学论坛报今日肿瘤

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